دانشگاه آزاد اسلامی
واحد ارومیه
( MSc) پایان نامه کارشناسی ارشد گرایش میکروبیولوژی
موضوع :
)) Hirudo orientalis خارجی و داخلی زالوی طبی (( شناسایی فلور میکروبی
( با تاکید بر سکوم گوارشی)
استاد راهنما :
جناب آقای دکتر نوید دین پرست جدید
اساتید مشاور :
جناب آقای دکتر مجید نوجوان
سرکار خانم دکتر صدیقه ذاکری
نگارنده :
صالح عسگری
1392-1391
تشکر و قدر دانی:
در آغاز بر خود واجب می دانم از زحمات فراوان استاد گرانقدرجناب آقای دکتر دین پرست
جدید، الگوی برجسته علم و اخلاق که با راهنمایی ها و همراهی خود در کلیه مراحل پایان
نامه بنده را به صحت و سلامت علمی و اخلاقی به سر منزل مقصود رسانیده اند
سپاسگزاری نمایم.
از استاد ارجمندم جناب آقای دکتر مجید نوجوان که همواره راهنما و دلسوز تمام دانشجویان
بوده اند و بنده از مشاوره ایشان در طول انجام پایان نامه بهره مند بوده ام کمال
سپاسگزاری وامتنان را دارم.
بدینوسیله مراتب سپاس و تشکر خود را از سرکار خانم دکتر صدیقه ذاکری که همواره
در طول مراحل پایان نامه همراه بنده بوده اند ابراز می دارم.
همچنین اززحمات بی شائبه و مثال زدنی دوست عزیزم جناب آقای دکتر عباسعلی راز
که دلسوزانه راهنما و مشوق اینجانب بوده اند نهایت تشکر را دارم.
از کلیه همکاران محترم بخش بیوتکنولوژی انیستیتو پاستور ایران بویژه گروه تحقیقات
مالاریا و انسکتاریوم ملی ایران که در فضایی علمی و فرهنگی در انجام این پایان نامه
بنده را یاری رساندند سپاس و قدر دانی می نمایم.
تقدیم به پدرʻ مادرʻ خواهرʿ برادر و عموی عزیزم که در
تمامی مراحل زندگی و در طول تحصیل همواره
مشوق و همراه بنده بوده اند.
همانها که خداوند را در حال ایستاده ونشسته وآن گاه که بر پهلو خوابیده اند یاد))
می کنند و در اسرار آفرینش آسمانها و زمین می اندیشند می گویند بار الاها !
اینها را بیهوده نیافریده ای. منزه ای ! ما را از عذاب آتش نگهدار! ))
(( آیه ای از قرآن کریم ))
کاشکی هستی زبانی داشتی تازهستان پرده ها بر داشتی
هر چه گویی ای دم هستی از آن پرده ایی دیگر بر او بستی بدان
چکیده :
با توجه گسترش استفاده از زالو برای موارد درمانی واز آنجایی که سازمان نظارت بر غذا و دارو تصویب کرد که بعد از عمل جراحی استفاده از زالوها می تواند منجر به عفونت باکتریایی شود. FDA
در این مطالعه ما از کشت مستقل و کشت وابسته برای شناختن نشانه های اختصاصی میکروب های لوله گوارشی در Hirudo orientalis استفاده خواهد شد. زالوها با خاصیت طبی کمک بسیار عظیمی به دانش پزشکی امروزی داشته اند.یک پیچیدگی خطرناک برای رگ های کوچک جراحی شده سیاهرگی وجود دارد که باعث پایین آمدن جریان خون وموضعی شدن سازش ایمنی می شود. زالوها با خاصیت درمانی به شکل یک نیروی پنهان قوی مانع بسته شدن رگها وهمچنین گشاد کننده عروق هستند وباعث حرکت فعال خون می شوند. هدف ما از انجام این تحقیق شناسایی فلور میکروبی زالو گونه Hirudo orientalis.لذا این پروژه با تلفیق روش های معمول میکروبیولوژی وبیوشیمی با تکنیک های مولکولی به فلور میکروبی این زالوهای درمانی دست یافته واز این طریق آنها را شناسایی می کند.در این تحقیق پس از صید نمونه ازاستان های گیلان ومازندران ابتدا زالو ها را تشریح نموده وپس از تسلط کامل از لحاظ آناتومی زالو ، آنها را به دو گروه تقسیم نمودیم:دسته اول آنهایی که توسط خون توسط خون تغذیه نشدند و دسته دوم آنهایی که تحت خونخواری قرار گرفتند.
پس ازکشت وجداسازی میکروبی توسط تست های بیوشیمیایی آنها را مورد شناسایی قرار دادیم ودر آخر توسط تست های پیشرفته مولکولی نظیر PCR و Cloning وتعیین توالی نمونه ها با استفاده از ژن 16SrRNA هویت باکتری ها را مشخص نمودیم.

مقدمه :
توانایی زالو در هضم خون وترشح آنزیم های آنتی کواگولانت و واسودیلیتور به
طور همزمان منجر شد که سازمان نظارت برغذا ودارو زالو درمانی را به
عنوان روش مفید جهت درمان گرفتگی وجلوگیری از خون مردگی بعد از عمل
جراحی معرفی کند اما اگر بیماران به صورت موضعی ویا کلی دچار نقص
سیستم ایمنی باشند زالو درمانی منجر به عفونت زخم توسط باکتریهای دستگاه
گوارش می شود.عفونت باکتریایی در بالاتر از 20% بیماران اتفاق می افتد اگر
قبل از زالو درمانی بیمار آنتی بیوتیک مصرف کرده باشد این عفونت سرکوب
می شود.یکی از باکتری های مستقر در دستگاه گوارش زالو Aeromonas
می باشد که باعث مرگ سایر میکروارگانیسم ها می شود وایجاد عفونت می کند.
زالوهایی که از خون تغذیه نمی کنند نظیر Eropobdella punctata اغلب
دارای سه باکتری Pseudomonas sp ، Aeromonas sp وKlebsiell sp
تحت عنوان همزیست در دستگاه گوارشی خود هستند .
زالوها خود به تنهایی می توانند منبع تولید آنتی بیوتیک باشند .این ترکیبات
پپتیدی بسیار سریع تر وآسانتر ازآنتی بادی ها در بدن منتشرمی شوند ترکیبات
آنتی باکتریال پپتیدی زالو ممکن است به درمان بیماری انسان نیز کمک کند.
در هنگام خونخواری، زمانیکه زالو از خون اشباع شد از محل گزش، خود به
خود جدا می شود. معمولا”این زمان 20 دقیقه پس از شروع گزش به طول
می انجامد.
به طور معمول تعدادی انگل در دستگاه گوارش زالو وجود دارد اما در بدن
انسان نمی تواند زنده بماند ودر واقع تهدید کننده سلامت انسان نیست اماباکتری
ها، ویروس هاو انگل های ناشی از خون قبلی خورده شده می تواند ماهها در
بدن زالو فعال باقی بماند ومجددا” به انسان منتقل شود.بیماری هایی از قبیل
از این طریق از فردی به فرد دیگر منتقل می شود.بهHepatitisBوHIV
همین دلیل پس از یک بار استفاده از زالو به هیچ عنوان نباید از آن برای
درمان فرددیگری استفاده شود وبلافاصله باید آنرا از بین برد.
در هنگام خونخواری باید از نزدیک کردن آتش ،سیگار،نمک ،صابون ویا مواد
محرک شیمیایی نظیر الکل ،سرکه به زالو جدا” خودداری شود زیرا موجب
بالا آوردن خون از قسمت درونی دستگاه گوارش یعنی جایی که چینه دان قرار
گرفته می شودو این مسئاله احتمال انتقال باکتری عفونت زا به زخم بیمار را
افزایش می دهد.
بررسی فلورمیکروبی خارجی سطح بدن زالوومقایسه آن با فلور میکروبی درونی
دستگاه گوارش وارتباط آنها با یکدیگر در این تحقیق مسأله مهمی است که تا
کنون در ایران تحقیقی در این رابطه انجام نشده است.
: فصل اول
کلیاتی
در ارتباط
با زالو
زالوها کرم های حلقوی هستند که به کرم های خاکی شباهت دارند ولی از لحاظ آناتومی با آنها متفاوتند.
کلمه زالو به زبان عربی به معنای ویدان یا علق می باشد . علق نام ویژه زالوست
و ویدان به معنای انواع کرم هاست که شامل زالو نیز می شود.

Scientific classification: Kingdom:Animalia Phylum:Annelida Class:Clitellata Order: Hirrudinida Family:Hirrudini
Genus:Hirrudo
Species:orientalis
زالوها در آب های شیرین˓کم عمق ˓مرداب ها˓باتلاق ها˓زیرصخره ها˓قطعه های شناور ویا به صورت یک شیء در کف آب زندگی می کنند.شب رو هستند و شب به شکار می روند . همچنین قادر به درک نور˓بو˓صدا˓لمس˓گرما وارتعاش می باشند.
خصوصیت اصلی مورفولوژیکی زالوها همانند یکدیگر است.حیوان کاملا” بالغ
حدودا” 20 سانتیمتر طول دارد که به رنگ سبز˓قهوه ای ویا متمایل به سبز-قهوه ای با ترتیبی از خطوط باریک قرمزدر ناحیه پشتی هستند. سطح پشتی تیره تر از سطح شکمی می باشد.
بدن تمام زالوها از 33 قطعه تشکیل شده است که 26 قطعه آن در قسمت جلویی و 7 قطعه آن در قسمت انتهایی قرار دارد. دارای دو اندام مکنده که یکی در قسمت جلو ودیگری در قسمت انتهایی بدن قرار دارد که اندام مکنده جلویی و اندام مکنده انتهایی نامیده می شوند. اندام مکنده پشتی اصولاʺجهت چسبیدن حیوان به سطح نقشی همانند اهرم دارد نظر به اینکه اندام مکنده جلویی حول آن می چرخد . اندام مکنده جلویی جایی که بلعیدن غذای حیوان در آنجا صورت می پذیرد شامل آرواره ها و دندانها می باشد. 3 ردیف آرواره که در هر کدام 100 دندان در آن قرار دارد . دارای 5 زوج چشم در بالای سر شان هستند که تشخیص آن با چشم غیر مصلح دشوار می باشد.
از نظرتکثیر هرمافرودیت هستند یعنی زالوها دارای اندام های جنسی نر و ماده با هم هستند ولی برای جفت گیری باید دوجاندار به یکدیگر بچسبند وهر کدام گامت نر خود را به گامت ماده دیگری برساند. سلول تخم تشکیل شده در مایعی ژله مانند از زالو جدا شده و به محیط اطراف می چسبند. هر زالو پس از یکی دو بار زایمان می میرد.
دستگاه دفعی شامل 17 زوج قطعه به نام متانفریدیا هستند که در قسمت کناری
سطح شکمی یک شبکه سراسری را ایجاد کرده ولوله مترشحه نعل اسبی را ایجاد
می کندکه به مثانه راه دارد. هر واحد نفریدیا شامل نفروستوم˓لوله ها و مثانه می
باشد.
دستگاه عصبی آنها ابتدایی بوده و فاقد سیستم اعصاب مرکزی هستند سیستم عصبی شامل 32 گانگلیون ˓حلقه های دور مری˓عقده های شکمی ورشته های عصبی می باشد .
دستگاه گوارش زالو شامل دهان ˓حلق عضلانی˓غدد بزاقی˓سه آرواره دندانه دار
شاخی مری˓چینه دان˓راست روده یا رکتوم و مخرج می باشد.
در لوله گوارشی زالو آنزیم های بیوشیمیایی و فلور باکتریایی حضور دارند که
هر نوع میکروارگانیسم اعم از باکتری ˓ویروس ویا تک یاخته غیر بومی را از
بین می برد. همچنین غدد بزاقی زالو موادی ترشح می کند که از جنبه درمانی
مورد توجه می باشد وپیش تر به ذکر آنها می پردازیم .این جانداران ریه نداشته وتنفس پوستی دارند.
پس از خونخواری بدنشان 10-2 برابر افزایش حجم پیدا می کند که هنگام
خونخواری آب خون مکیده شده را دفع نموده و خون تغلیظ شده در بدن جانور
باقی می ماند .
انواع زالو :
650 نوع از زالوها تا به حال شناسایی شده که مهم ترین آنها از نظر پزشکی مربوط به گونه های ذیل می باشد:

.1Hirrudinaria mathnillensis(Asian medicinal leech),
.2 Crobdella decora (North American medicinal leech)
.3H.orientalis
4. H.medicinalis
5.H.verbana
6 .H.troctina
تاریخچه:
صد سال قبل از اینکه مردم مغرب زمین (اروپا و آمریکا) زالو را بشناسند وبه
خواص درمانی آن آگاهی داشته باشند درخاورمیانه از زالو جهت مقاصد درمانی
استفاده می شده است .مصریها در 1500 سال قبل از میلاد مسیح از زالو برای
درمان بیماریها استفاده می کردند واز دیگر نقاط خاورمیانه بیمار به آنجا اعزام
می شده است. استفاده از زالوبرای درمان بیماریها سابقه طولانی در طب دارد
سابقه تاریخی آن به حدود 4000 سال قبل بر می گردد. ایران هم جزء کشور
هایی است که در تاریخ پزشکی خود از زالو درمانی استفاده می کرده است.
اروپایی ها تا قرن 19 زالو را موجودی بی مصرف ومزاحم می پنداشتندواز
قرن 19 به بعد به خواص درمانی آن پی بردند واز آن به بعد به طور وسیعی
برای درمان بیماریها از آن سود جستند. استفاده از زالو درمانی منحصر به اروپا
نمی شد در قرن 19 در ایالات متحده آمریکا نیز از زالوجهت درمان استفاده می
شده است. باکاهش تعداد زالو،پیشرفت مهارت ووسایل تشخیص بعد ازسال1830
محبوبیت زالو درمانی رو به کاهش نهادتا اینکه درسال 1884پی به خواص ضد
انعقادی وجداسازی چندین نوع آنزیم از جمله هیرودین از غدد بزاقی زالو توسط
مارکواردت، در سال های 1950 اهمیت پزشکی زالو را ثابت کرد.
زالو درمانی طی سال های 1980 دوباره رواج یافت. سازمان نظارت بر غذا و
دارو آمریکادر 24 ژوءن 2004 در آخرین اقدام مهم خود استفاده از زالو را
جهت مقاصد پزشکی قانونی اعلام کرد.

خواص زالو وکاربردهای درمانی آن
عمده خواص درمانی زالو مربوط به بزاق این جاندار است به طوریکه شاید بیش
از وزن بدنش قادر به تولید بزاق باشد . بزاق زالو شامل دو دسته از مواد هستند
که گروهی به نام نروترانسمیترهابر روی پایانه های عصبی عمل می کنند و
موجب تحریک عمومی روی نقاط طب سوزنی می شود ودسته دیگر که بر روی
گردش خون عمومی و مویرگ ها عمل کرده وبه عنوان ضد انعقاد ˓ضد تورم˓
ضد درد ایفای نقش می کند.
غدد بزاقی زالو هنگام مکیدن خون مواد متنوعی ترشح می کند که معروفترین و
مهم ترین آن هیرودین است . هیرودین قوی ترین ماده ضد انعقادی می باشد که
باعث کاهش درد موضعی هنگام نیش زدن می شود و در واقع به نوعی خاصیت
بی حس کنندگی دارد. بجز هیرودین آنزیم های دیگری که در ذیل به آنها اشاره
می کنیم :
هیالورونیداز:
آنزیم هیالورونیداز باعث خاصیت ضد انعقادی می شودومانع لخته شدن خون می
شود .همچنین این آنزیم خاصیت آنتی بیوتیکی دارد وموکوس را نیز حل می کند.
زالو برای اینکه بتواند خونخواری را انجام بدهد باید مانع لخته شدن خون بشود
برای این کار بزاق خود را همزمان با مکیدن به محل گزش تزریق می کند و این
عمل را بوسیله آنزیم هیالورونیداز انجام می دهد.
هیستامین:
هیستامین خاصیت باز کنندگی و گشادکنندگی عروق را دارد.
بدلین:
این آنزیم مهار کننده پروتئاز مانند تریپسین˓کیموتریپسین یا پلاسمین است که
دارای فاکتور های تورم وپخش شدن در بافت می باشد.
آسپیراز:
یک آنزیم قوی ضد تجمع پلاکت ها می باشد که باعث افزایش سرعت جریان
خون می شود.
اگلین:
ضمن اینکه یک آنزیم ضد تورم است ضد اکسیداسیون و ضد رادیکال نیز می
باشد
داستابیلاز:
این آنزیم که قدرت ضد تجمع پلاکتی بسیار قوی دارد نقشش از بین بردن لخته
خون می باشد.
لیپاز واستراز:
این آنزیم ها خاصیت لیپولیتیک دارند برای مثال چربی را آب کرده و استفاده
های درمانی از آن شروع شده است.
آنتی الاستاز:
این آنزیم از طریق کنترل عمل الاستاز فعالیت می کند والاستین قسمت سطحی
را به خصوص در پوست کاهش می دهد.
هم اکنون در شمار کثیری از کلینیک های آمریکا واروپا از زالو جهت رقیق شدن
خون متعاقب آنژیوپلاستی،گرافت های پوستی و پیوند اعضا در جهت تسریع
خون رسانی موضعی و پیشگیری از انعقاد خون در عروق ،ضایعات پوستی و
زیبایی پوست وحتی تقویت سیستم ایمنی بدن استفاده طبی بعمل می آید.
اهمیت فلور میکروبی دربدن جانداران :
لوله گوارشی اغلب جانداران از جامعه میکروبی بسیار پیچیده ای تشکیل شده
است که این میکروب ها به عنوان فلور نرمال نامیده می شوند ودارای زندگی
همزیستی با میزبان می باشند برای مثال روده بزرگ در انسان از 400 گونه
مختلف باکتریایی تشکیل شده است در حالیکه بسیاری از حشرات دارای جامعه
میکروبی کمتری در دستگاه گوارش خود هستند که شامل 10 گونه میکروبی
می باشد.
فلور نرمال را به دودسته تقسیم می کنند:
1.فلور مستقر یا ساکن :
شامل انواع تقریباʺثابتی از میکروارگانیسم ها در محل خاص خود می باشد
که در صورت آسیب قادر بازسازی وجبران باکتری می باشد.
2.فلور موقت یا گذرا :
شامل میکروارگانیسم های غیر بیماری زا ویا آنهایی که بالقوه بیماریزا هستند
که به مدت زمان کوتاهی جایگزین می شوند. این ها از محیط بوده و در صورت
آسیب دیدگی قادر به جبران وتکثیرباکتری نمی باشند. نکته مهم اینجاست که فلور
موقت در صورت وجود فلور ساکن نمی تواند بیماریزا باشد اما در صورت وجود
تعداد بیش از حد فلور ساکن بیماری ایجاد می گردد. وجود فلور نرمال مانع رشد
باکتری های پاتوژن یا بیماریزا در بدن می گردد ومنجر به پدیده ای به نام تداخل
باکتریایی می شود.
جامعه میکروبی عملکرد بسیار مهمی برای میزبان دارد که شامل ممانعت از
رشد باکتریهای بیماریزا˓ تولید ویتامینهای ضروری ˓ تحریک سیستم ایمنی و
کمک به هضم مواد غذایی می باشد. در خونخواران بی مهره که توسط خون
تغذیه می شوند تصور بر این است که وجود همزیست جهت سلامت میزبان و
تهیه مواد ضروری از خون لازم و ضروری می باشد .
فلور میکروبی دردستگاه گوارش زالو :
لوله گوارشی زالو شامل میکروارگانیسم های سودمند می باشد و این مسإله منجر
به ایجاد بحث در مورد واکنش های مولکولی بین همزیست ومیزبان شد اگر چه
تا کنون مکانیسم خاصی در مورد تعامل بین همزیست وباکتری ارائه نشده است.
خون بلعیده شده توسط زالو پس ازورود به دهان از حلق ومجرای عضلانی مری
عبور کرده ووارد 10 زوج کیسه های چینه دان می شود. جامعه میکروبی زالو
درچینه دان وروده مستقر هستند کیسه های چینه دان قابلیت اتساع دارند یعنی این
امکان را به زالو می دهد که حدوداٌ پنج برابر وزن بدنش خون بخورد ویک
وعده غذایی زالو که حدوداٌ 8-6 میلی لیتر خون می باشد نیازتغذیه ایش را به
نامیده Intra luminal fluid مدت 6 ماه بر آورده می کند.خون بلعیده شده
می شود که پس از جذب آب ونمک در چینه دان ذخیره می شود.
در حالیکه دستگاه گوارشی اغلب حیوانات از جامعه میکروبی پیچیده ای تشکیل
شده ،دستگاه گوارش زالو به طور غیر معمول از یک جامعه میکروبی ساده
(عضوی Rikenella و Aeromonasبه نامهای فقط دو گروه از باکتریها
از گروه باکتروئیدس) حضور دارند. باکتری آئروموناس در شرایط آزمایشگاهی
قابل کشت است اما گروه دوم ریکنلا که به طو معمول مهارکننده دستگاه گوارش
مهره داران می باشد در حضور اکسیژن قادر به رشد نمی باشند.
چندین عملکرد همزیست به نفع میزبان می باشد از جمله :
کمک می کند اخیراٌ بر اساس به هضم خون خورده شده توسط میزبان .1
مطالعات ثابت شده است که در بدن میزبان هیچگونه آنزیمی شناسایی نشده
است ولی در آئروموناس تولید چندین آنزیم همولیتیک خارج سلولی کشف
شده است اما با وجود توانایی همزیست جهت لیز گلبول قرمز،خون ذخیره شده
برای ماه های طولانی دست نخورده باقی می ماند.بیشتر تحقیقات اخیر نشان
داده است که میزبان آنزیم پروتئاز رابه درون روده جایی که هضم واقعی
صورت می گیرد ترشح می کند.
2. میزان مواد مغزی در خون پائین می باشد برای مثال میزان ویتامین
ر خون پائین است بنابراین همزیست نقش موثری در سنتز مواد دB12
مغزی ایفا می کند.
در دستگاه گوارش Aeromonas اینکه فقط تنها یک گونه از باکتری .3
زالو یافت می شود غیر معمول می باشد و کشت آزمایشگاهی نیز این مسأله
را ثابت کرد و بیان کننده این است آٌئروموناس از تکثیرسایر باکتریها جلوگیری
می کند ودر واقع از رشد سایر باکتریهای غیر بومی در چینه دان جلوگیری
می کند.

عوامل موثر جهت تعیین خصوصیات همزیست میکروبی :
شناخت ویژگی های میکروب همزیست از نظر زیست شناسی حیوان وکاریرد
های پزشکی زالو بسیار مهم می باشند.چندین فاکتور جهت مشخص نمودن این
ویژگی ها بیان شده است که عبارتند از:
1.سیستم کمپلمان خون مهره دار در بدن زالو فعال باقی می ماند وباکتری های
حساس را از بین می برد.
2.سلول های هموسیت و ماکروفاژها توسط زالو باکتری های حساس را فاگوسیت
می کنند.
3.ترکیبات ضد میکروبی هم توسط میزبان وهم توسط همزیست میکروبی ترشح
می شوند. اما این ترکیبات بدرستی هنوز شناسایی نشده اند به علاوه فلور
میکروبی بومی با فلور میکروبی غیر بومی جهت بدست آوردن مواد مغذی و
فضا رقابت می کند.
شکل مقابل بیان گرتعامل اجزأ شرکت
کننده میزبان بی مهره ، باکتری همزیست
وخون میزبان مهره دار که زالو از آن تغذیه
می کند می باشد.
.
خصوصیات باکتری Aeromonas :
Aeromonas مربوط به خانواده انتروباکتریاسه می باشد ودر گروه ویبریوناسه
دسته بندی می شود. Aeromonas باسیل گرم منفی ، تخمیر کننده قند گلوکز، بی
هوازی اختیاری ، تست اکسیداز مثبت ، دارای حرکت (حرکت بوسیله تاژک
قطبی) و مقاوم به عامل ویبریواستاتیک 129\ oوهمچنین جهت رشد به Nacl
نیازی ندارد.
باکتری جنس Aeromonas دارای خصوصیات فریبنده ای هستند که بسیار مورد
توجه زیست شناسان قرار گرفته اند اول آنکه تعداد زیادی از گونه های بیماریزا
از هر دو گونه حیوانات خونگرم وخونسردکه انسان هم شامل آن می باشد وجود
دارد. دوم بسیاری از گونه ها نظیر A. hydrophila بسیار شایع هستند ودارای
مکانیسم هایی هستند که می توانند خودشان را با شرایط محیطی تطبیق بدهند.
سوم این که Aeromonas آنزیم های خارج سلولی زیادی را ترشح می کند
که نقش بسزایی در اکولوژی ، بقإ وبیماریزایی این میکروارگانیسم دارد.
اگر چه فیلوژنی وابسته به تکامل آن نامعلوم است اما آنزیم های متنوع خارج
سلولی ومکانیسم های ترشح آنها نیازمند دقت و جزئیات آن مورد توجه می باشد.
گونه های Aeromonas فاکتور های ویرولانس زیادی تولید می کنند که مهم
ترین آنها عبارتند از :
1.همولیزین
2.انتروتوکسین
3.سیتوتوکسین
4.ادهسین
گونه های Aeromonas از عوامل ایجاد مسمومیت غذایی(از زمانیکه از
غذاهای خام و نپخته جدا شد) ،عفونت زخم بیماران، گاستروآنتریت ،سپتی
سمی ، جراحت بافت سخت و عفونت خون در انسان می باشد.به علاوه حضور
این باکتریها ممکن است منجر به نقص وکاهش توانایی سیستم ایمنی در بدن
بیماران گردد.عفونت توسط Aeromonas در بالاتر از 20 درصد بیماران
اتفاق می افتد مگر اینکه قبل از استفاده از زالو جهت درمان بیمارانی که تحت
عمل جراحی قرار گرفتند آنتی بیوتیک مصرف کرده باشند.
دو گونه جدا شده از مدفوع انسانی A. hydrophila و A. veronii biovar sobria می باشدکه همچنین توانایی کلونیزاسیون لوله گوارشی را نیز دارا
هستند.
فصل دوم :
مروری بر
مطالعات
گذشته
در سال 1997 سه دانشمند به نام های Pemberton،Kidd ،Schmidt برروی
12 گونه از Aeromonas شامل :A.hydrophila،A.sobia،A.salmonicida
A.caviae ،A.trota،A.veronii،A.andaei،A.eucrenophila،A.media،
A.eteropelogenes،A.ichthiosmia،A.schubertii تحقیق انجام دادند.
این تجزیه تحلیل ها بر اساس متدهای کلونینگ ،سکونسینگ وبیان
ژن های ناهمگن ازAeromonas جهت به رمز در آوردن پروتئین های خارج
سلولی وپروتئین های مشمول در مسیر تسهیل انجام شد.این تحقیق مکانیسم های
وخواص پروتئین های ترشح شده از فضای پری پلاسمیک غشا وورود آن را
به فضای میانی غشا مشخص نمود. مشخصه گونه های Aeromonas توانایی
آنها در ترشح آنزیم های مختلفی است که در بیماریزایی وتطبیق با شرایط محیط
اطراف نقش دارند.در این میان موارد مطالعه ترشح آنزیم های بتا لاکتاماز،لیپاز،
انتروتوکسین های همولیتیک،پروتئاز،کیتیناز،نوکلئازو آمیلاز در Aeromonas
هستند به علاوه نسخه هایی از ژنهای کد شده توسط آنزیم تولید شده .انتظار برای
آنزیم کیتیناز از این تعداد کپی نشان داد که تکامل اندکی درارتباط با میزانِ DNA
اتفاق افتاده وتنها محدود به تشابه در میزان پروتئین می باشد . به درستی تعدادی
از ژنهایی از قبیل انزیم نوکلئاز A.hydrophila هیچ گونه تشابهی با انواع پرو
کاریوت ویا یوکاریوت تعیین توالی شده نداشت.این تحقیق مشخص کرد چطور
این ژنها استخراج می شوند .از کجا سرچشمه می گیرند وچرا باکتری
Aeromonas چنین میزان فراوان ومتنوعی از این ژنها را داراست.
در سال 1998 محققی به نام Joerg Graf تحقیقی بر روی زالوی پزشکی انجام
داد .از زالوی پزشکی بعد ازعمل جراحی جهت درمان بیمارانی که مشکل انسداد
ویا گرفتگی ویا لخته در عضوجراحی شده دارند جهت رفع این موارد وکمک به
برقراری خون رسانی به این اعضا استفاده می شود.ثابت شده 20 در صد از
بیمارانی که پس از عمل جراحی تحت زالو درمانی قرار می گیرند محل جراحی
آنها عفونی می شود مگر این که بیمار از قبل آنتی بیوتیک مصرف کرده باشد.
اجزا شرکت کننده در ایجاد عفونت نیاز ما را برای شناخت بهتر فلور باکتریایی
دستگاه گوارشی زالو اثبات کرد.در این مطالعه ابتدا5-4 میلی لیتر خون استریل
که دمای آن37به درجه رسیده بود درون یک لوله سانتریوفوژریخته وپس از
اینکه سر لوله با پارافیلم بسته شد به زالواجازه داده شد که به پارافیلم بچسبدو پس
از وارد کردن نیشش از این خون تغذیه کند پس از تشریح زالو از لوله گوارشی
بر روی محیط بلاد آگار کشت تهیه شد و به مدت یک شبانه روز در دمای 30
درجه سانتی گراد انکوبه گردید.نتایج حاصله از تست های بیوشیمیایی منجر به
جداسازی وشناسایی Aeromonas veronii biovar sobria گردید.همچنین
شناسایی این گونه توسط تست های مولکولی وتعیین توالی از ناحیه ژن متغیر
کد شده srRNA 16 نیز تائید شد.در سنجش وتعیین عیار جامعه میکروبی
مشتقی از ژن مقاوم به ریفامپین از باکتری های جدا شده در خون و عده غذایی
زالو قرار داده وبه او خورانده شد. جامعه میکروبی شرکت کننده در لوله
گوارشی زالو فورا” تشکیل شد وغلظت آن مشابه آنچه در فلور باکتریایی طبیعی
بود رسید.در12 ساعت اول در شرایط درونی بدن موجود زنده زمان دوبرابر
شدن 1.2 ساعت در دمای 23 درجه سانتیگراد بود بعد از 12 ساعت تراکم
باکتریها به 10×5 رسید سپس افزایش تعداد باکتری های زیست پذیرمتوقف
شد واین امر موجب تقلیل چشم گیر در سرعت رشد باکتری ها شد.
این اطلاعات اثبات کردند که گروه اصلی باکتری های کشت داده شده از دستگاه
گوارشی زالو Aeromonas veronii biovar sobria بودند و اینکه زالوی
پزشکی می تواند به عنوان مدلی جهت چگونگی مشارکت گونه های
Aeromonas در لوله گوارشی زالو استفاده شود.
در سال 2000 دو محقق به نام های Stefan Indergand وJoerg Graf پی
بردند که زالوی پزشکی دارای باکتریهای خالصی ازگونه Aeromonasveronii
در دستگاه گوارش خود می باشد چنین ویژگی برای دستگاه گوارشی غیر معمول
می باشد زیرا در تشکیل جامعه میکروبی گروه پیچیده ای از باکتریها حضور
دارند.سوال مهمی که در اینجا مطرح شد این بود که جهت واکنش های همزیستی
و کاربرد های پزشکی زالو بعد از عمل جراحی آیا دیگر باکتریها می توانند
تکثیرکنند ویا در نهایت در لوله گوارشی زالو باقی بمانند وچه فاکتورهایی برای
بیان این ویژگی ها سهیم هستند ؟
با استفاده از تعیین عیار کلونیزاسیون ما قادر خواهیم شد از راه آزمایش توانایی
باکتریهای کلینیکی جدا شده را با باکتریهای همزیست در زالو مقایسه کنیم.
همزیست Aeromonas veronii به خوبی تکثیر می کند و به مدت هفت روز
در دستگاه گوارشی زالومقاومت می کند. در یک مقایسه این دو دانشمند نشان
دادند تکثیر Psedomonas aeroginosa و Staphylococcus aureus
در دستگاه گوارشی حیوان نقش مهاری داشت در مقایسه با رشد در شرایط
آزمایشگاهی که به عنوان کنترل در نظر گرفته شده بود.این مسئله مشخص نمود
که خون خورده شده در دستگاه گوارش زالو تغییراتی حاصل کرده است هر چند
که این دو گونه قادر خواهند بود در دستگاه گوارشی به مدت هفت روز فعال
باقی بمانند. برای گونه Escherichia coli زیست پذیری به میزان 1000
برابر در عرض42 ساعت کاهش پیدا می کند. کاهش زیست پذیری E.coli
می تواند ممانعت کند توسط دخالت با فعال سازی اعضای پیچیده کمپلمان که در
خون حاضر هستند وبیانگر این است که اعضای فعال وپیچیده کمپلمان دردرون
بدن زالو فعال باقی می ماند و از تکثیر باکتری های حساس جلوگیری می کند.
بنابر این خواص آنتی میکروبی موجود در خون مهره داران که توسط زالو
خورده شده در بیان ویژگی وخصوصیت همزیست میکروبی زالو پزشکی
Aeromonas veronii نقاط مبهم را روشن ساخت مضاف بر اصلاح وپیرایش
خون درون دستگاه گوارش زالو. در این تحقیق ما بررسی هایمان را بدون
حضور باکتری Aeromonas توسعه دادیم سه گونه مختلف باکتریایی از خون
بیماران جدا شد.(Pseudomonas aeroginosa،E.coli وStaph aureus )
این گونه ها از نظر ایجاد سپتی سمی درخون بیماران بسیار حائز اهمیت بوده
و می توانند از ایجاد عفونت در زخم منشاء بگیرند. در این تحقیق مطالعات
بررویHM21R مشتقی از ژن خودبخودی موتانت مقاوم به ریفامپین مشتق شده
از HM21 انجام شده است HM21وHM221 دو ژن شناخته شده از A.veronii
جدا شده از چینه دان زالو هستند که خصوصیت نژادی این گونه از باکتری توسط
آنها تعیین می شود.
در سال 2002 سه محقق به نام های Moura Martins ، Falcon Maquez و
Tomomasa Yano شیوع وانتشار سم توکسیک Aeromonas جدا شده از غذا
وعفونت انسانی را مورد بررسی قرار دادند.از 194 Aeromonas جدا شده
(99 مورد از غذا و95 مورد از منابع کلینیکی) که از نظر گونه وسم تولید کننده
مورد تجزیه وتحلیل قرار گرفتند.در این تحقیق اساس کار بر مبنای تست های
بیوشیمیایی انجام شد . ابتدا Aeromonas در محیط آب پپتون کشت داده شد و
به مدت 24 ساعت در دمای 37 انکوبه گردید .پس از انکوباسیون نمونه ها بر
روی محیط کشت Blood Agar5 درصد کشت داده شدند وبه مدت 24 ساعت در
دمای 37 درجه انکوبه شدند .برای تشخیص جنس های Aeromonas از تست
های بیوشیمیایی نظیر حرکت،تشخیص گرم،سیتوکروم اکسیداز،تخمیر گلوکز،
کاتالاز،حساسیت به عامل O/129 ،هیدرولیز اسکولین،شناخت L-Arabinose
،تولید گاز از گلوکز،ایندول،تشکیل H2S از سیستئین و ظرفیت رشد تحت شرایط
اکسیداتیو و فرمنتیو استفاده شد.99 مورد جدا شده ازمنابع غذایی شیر ،گوشت و
سبزیجات رستوران دانشگاه UNICAMP و95 نمونه کلینیکی از آزمایشگاه
میکروبیولوژی بیمارستان دانشگاه Sao Paulo بدست آمد.از 95 نمونه کلینیکی
35 مورد از مدفوع ،56 مورد از عفونت زخم و4 مورد از افراد مبتلا به سپتی
سمی جدا گردید.از ژن AH191 گونهAeromonas hydrophila به عنوان
کنترل مثبت سم سایتوتوکسیژنیک وازژن K12C-600 گونه Escherchia coli
به عنوان کنترل منفی سم سیتوتوکسیژنیک استفاده شد.
از نمونه های کلینیکی جدا شده 29.4 درصد انتروتوکسیژنیک،43.1 همولیتیک
و89 درصد سیتوتوکسیژنیک بودند.در بین نمونه های جدا شده از غذا 18.2
درصد انتروتوکسیژنیک،17.1 در صد همولیتیک و72.7 درصد سیتوتوکسیژنیک
بودند.A.veronii وA.sobria انتروتوکسین وسیتوتوکسین بیشتری رانسبت به
سایر گونه ها تولید می کردند در حالیکه A.veronii وA.salmocidae سلولهای
جدا شده از همولیزین را تولید می کردند.اغلب گونه های جدا شده سیتوتوکسین
را تولید می کردند که 81 در صد برروی Vero (کلیه میمون سبز) وسلول
تخمدان همستر چینی (سطح کشت A.veronii )تشکیل حفره می دادند.
تحقیقات مولکولی وابسته به تکامل در سال 2005 توسط Utevsky SergeY
وTrontelj Peter گونه ای از Hirrudo که قبلاʺ در شناختش غفلت شده بودبه
نام Orientalis نوعی از زالوی پزشکی معرفی کرد.در این تحقیق نوع جدیدی
از زالو که رسماٌ شرح داده شدH.orientalis sp بود.اغلب به سهولت قابل
تشخیص می باشد سایز آن حدوداٌ بیش از108 میلی مترمی باشد.رنگ آن در
سطح پشتی سبز چمنی با دو جفت نوار نارنجی وابسته به طول وحاشیه جانبی
با نوار های طولی زرد رنگ می باشد.سایز اپیدیدیم متوسط و به طور یکنواخت
می باشد. منشإ شناخت این جنس از زالو ترانسکائوکاسیا،ایران وازبکستان می
باشد.H.orientalis به طور وسیع در پزشکی مورد استفاده قرار می گیرد به
عنوان زالوی پزشکی. دانسته های ما در ارتباط با توزیع ،عادات ویژه،نگهداری
وحفاظت از آن اندک می باشد.این تحقیق شامل کلید هایی جهت شناخت گونه های
جنس Hirrudo می باشد. جهت شناخت گونه ها وارتباط فیلوژنی آنها با هم از
توالیDNA میتوکندری ژن 12SrRNA و زیر واحد سیتوکروم اکسیداز که
همانند ریبوزوم های هسته ای درونی بکار می رود جهت رونویسی از دو ناحیه
برای تعیین فاصله ژنتیکی با بیشترین دقت در ارتباط با گونه ها. با وجود اینکه
H.orientalis از نظر شباهت بسیار به H.medicinalis نزدیک می باشد و
H.verbana وH.troctina در خصوصیات خارجی وداخلی به آسانی از بقیه
گونه ها قابل تشخیص هستند.تجمع رنگ ها در سطح پوست اغلب به شناخت
خصوصیات وتعیین هویت زالوها کمک می کند.H.orientalis در داشتن پوست
نازک ،نوارهای نارنجی رنگ عمقی واضح با H.verbana که دارای نوارهای
پهن بر روی سطح پوست وبه رنگ نارنجی کم رنگ متفاوت می باشد.
ناحیه شکمی در H.verbana به رنگ سبز متمایل به زرد می باشد که با یک
جفت نوار مشکی در قسمت جانبی شکم پوشیده شده است. H.orientalis و
H.medicinalis با وجود خال های سیاه مشخص در حاشیه بدنشان قابل
تشخیص می باشند. خال های مشکی در سطح پشتی H.orientalis دایره ای
ویا مربعی شکل هستنددر حالیکه H.medicinalis دارای خال های کشیده و
باریک هستند که در امتداد یکدیگر قرار دارند. H.orientalis وH.troctina
از لحاظ رنگدانه پوستی در سطح پشتی بسیار به یکدیگر شبیه می باشند اما با
مقایسه رنگ سطح شکمی به سهولت از یکدیگر قابل تشخیص می باشند.
خصوصیت برجسته H.troctina حضورجفت نوارهای مشکی دارای پیچ وخم
در امتداد طول سطح شکمی می باشد.خصوصیات دستگاه تولید مثل نیز در گونه
های مختلف متفاوت می باشد.
نتایج مولکولی بدست آمده نیز نشان داد یک رابطه قوی بر اساس تفاوت گونه
های زالوپزشکی وجوددارد و این مسئاله بیانگر تإخیر در تغییر ژنتیکی ودر
نتیجه واگرایی گونه ها شده است.
با این همه بسیاری از ارتباطات خویشاوندی بین گونه ها به طور واضح کمتر از
این مسئاله حمایت می کند.
بسیاری از حیوانات دارای سیر تکاملی همسو با باکتری های همزیست خود می
باشند.این باکتری ها مواد غذایی غیرقابل دسترس را برای میزبان فراهم می کنند
وهمکارانش سویه های جدیدی ازباکتری Rebecca B.Budinoff دراین تحقیق
همزیست را بعد از خونخواری3 زالو که یکی از آنها زالوی غول پیکر آمازون
بودPlacobdelloides و2زالوی دیگر از گونه Haementeria ghilianii
کشف کردند.این میزبانها دارای اشکال متفاوتی در مری و دستگاه گوارش خود
هستند جایی که باکتریها در آنجا واقع هستند. تعیین توالی باکتریها با استفاده از
16 مشخص کرد که این همزیست ها در دو رده جدا مربوط بهSrRNA ژن
قرار گرفتند همچنین آنها این باکتری ها را Gammaproteobacteria کلاس
DNA از لحاظ فیلوژنی بررسی کردند .در این رابطه تعیین توالی
در دیگر باکتری های همزیست از جمله Alphaproteobacteria از زالوی
جنس Placobdella ،Aeromonas veroni ازH.medicinalis و
Rickettsia sp ازHemiclepsis marginata مشخص شد.
جمع بندی نتایج نشان داد که هضم خون در زالو وکسب مواد غذایی ضروری
ساخته مشارکت باکتریها می باشد که حداقل پنج مرتبه در طول تاریخ تکاملی
آنها اتفاق افتاده است.
Phylogeny of 16S rRNA sequences of leech-associated symbionts in the context of other animal symbionts and various proteobacteria, rooted with gram-positive taxa. The tree is a strict consensus of two equally parsimonious trees depicted as a phylogram. Jackknife support values greater than 75% are indicated. The five bacterial clades or lineages associated with blood-feeding leeches are outlined with dashed boxes.
s
مطالعات کشت پایه برروی جامعه میکروبی در روده زالوی پزشکی بر روی
گونه های مختلف باکتری Aeromonas فوکوس کرد که تنها گونه منحصر به
فرد همزیست در لوله گوارشی زالو می باشد.در این مطالعه که توسط Paui L
Worthen ، Cindy J Gode ،Joerg Graf در سال 2006انجام شد تحلیل ژن
کلون شده از کتابخانه ژنی 16SrRNA نیزحضور A.veronii وهمزیست دیگری
به نام pw3 نوع جدیدی از ریکنلا را در چینه دان آشکار کرد.تنوع جامعه
باکتریایی نیز در روده زالو مشخص گردید ودر آنجا باکتری های همزیست
بیشتری کشف گردید که شامل اعضای Proteobacteria-δ ،γ ،α
Fusobacteria،Firmicutes وBacteroidetes می باشد . به میزان فراوانی
حضور باکتری A.veronii وشکل جدید pw3 درجامعه میکروبی روده اثبات
شد. در حالیکه حضور دیگر باکتریها به صورت زودگذر وناپایدار وتعدادشان
اندک می باشد.هیچکدام از دو زمان، بعد از خونخواری ویا خوردن خون دفیبرینه
باعث تغییر در شناسایی عضو غالب در جامعه میکروبی نمی شود تجزیهRFLP
جهت بازبینی از نتایج کتابخانه ژنتیکی به عنوان بیانگر اطلاعات وسیع تر مورد
استفاده قرار گرفت .حضور دو عضو در جامعه باکتریایی چینه دان فرصتی را
ایجاد کرد جهت رسیدگی به تعامل همزیست-همزیست وهمزیست-میزبان در مدل
طبیعی دستگاه گوارشی زالو.
قبل از این تحقیق هیچ گزارشی خصوصیات جامعه باکتریایی موجود در روده
زالوی پزشکی را مطرح نکرده بود.
در سال 2007 محققانی با نام هایStefan Kuffer،M.Rabinowitz،C.Silver
وjoerg Graf جهت شرح باکتریهای شرکت کننده دستگاه گوارشی H.verbana
وزالوی پزشکی مدلی طراحی کردند که این مدل باکتریهای شرکت کننده در چینه
دان را از لحاظ پیدایش و اصل ،A.veronii وRikenella-like bacterium
معرفی کرد. ازاثر ژن موتانت نشان دار شده(STM) جهت شناسایی ژن مورد
نیاز برای ردیابی چگونگی ایجاد جامعه میکروبی در لوله گوارشی استفاده شد.
از 3850 ژن ترانسپوزون موتانت غربال شده 46 ژن موتانت جهت ایجاد جامعه
میکروبی شناسایی شد. قبلا” ما نشان دادیم سیستم کمپلمان در خون خورده شده
توسط زالو دردرون چینه دان فعال باقی می ماندواز سرم موتانت حساس جهت
ایجاد جامعه میکروبی جلوگیری می کند.26 سرم موتانت حساس با موفقیت
غربال شد.20 سرم مقاوم موتانت باقی مانده در این تحقیق شرح داده شد و بینش
جدیدی رانسبت به واکنش همزیست- میزبان آشکار ساخت.در شرایط طبیعی بدن
تلاش برای رقابت باکتری ها سنجیده شدوبا سطح کلونیزاسیون موتانت ها یی که
از نوع وحشی جدا شد مقایسه گردید.موتانت های ضعیف شده و کلونیزه شده از
لحاظ تغییر در ساختاربه پنج رده تقسیم شدند:تغییر سطحی،تنظیمی،تغذیه
کننده،اثر متقابل میزبان وعملکرد ناشناخته. یکی از موتانت های نشان دار
شده JG736 با ترانسپوزون الحاق شده در lpp رمز گذاری کننده لیپوپروتئین
خصوصیاتش مشخص شده است.
این موتانت دارای بیش از 25000 نقص می باشد نسبت به گونه وحشی پس از
گذشت 72 ساعت وافزایش حساسیت به سدیم دودسیل سولفات بیانگر حضور
خواص آنتی میکروبی در چینه دان می باشد .گروه ژنهای شناخته شده در این
تحقیق با یافته های قبلی از ژن موتانت نشان دار شده که شامل باکتریهای بیماریزا
می باشد همسو و سازگار می باشدو پیشنهاد کننده این است که به موازات
احتیاجات مولکولی مفید ویا منجر به تشکیل جامعه میکروبی بیماریزا
در میزبان می شود.

سازمان نظارت بر غذا ودارو اعلام کرد که استفاده از زالو بعد از عمل جراحی
می تواند باعث عفونت باکتریایی شود در سال 2008 ،محققان S.laufer ،
E.siddall و Joerg Graf با بکارگیری از کشت مستقل وکشت وابسته در تلاش
جهت تعیین خصوصیات فلورمیکروبی در چینه دان وروده زالوی H.orientalis
بودند.به طور شگفت انگیز دو گونه A.veronii وA.jandaei از کشت بدست آمد
گونه غیر قابل کشت بی هوازی Rikenella نیز از لوله گوارشی جدا گردید.
با استفاده ازژنSrRNA 16 توسط تکنیک RFLP سطح وگونه Aeromonas
مورد بررسی قرار گرفت دو گونه جدا شده ازچینه دان( Ho599 وHo636 ) و
روده (Ho603 و Ho635)ازدوزالوجدا شدند وجهت مشخص شدن خصوصیات
آنها توسط ژن gyrB توالیشان مشخص شد.تجزیه وتحلیل تعیین توالی ژن gyrB
نشان داد که هر دو باکتری A.veronii (Ho635وHo636) وA.jandaei
Ho599) وHo603) در زالوی H.orientalis حضور دارند. تعیین توالی از
لحاظ فیلوژنی مورد بررسی قرارگرفت. بابکارگیری 100 خود راه انداز ژنها
تکثیر گردید ومختص این جنس از باکتریها بود .جداسازی دوباره DNA و تعیین
توالی مجدد gyrB تایید کرد که تغییری در نمونه ها ایجاد نشده است.دقت بالای
خود راه انداز از تشابه این رده ها (90 و100 درصد) به ترتیب با گونه های
اجدادی A.veronii وA.jandaei حمایت می کند بنابر این ، این اطلاعات
نشان داد دو گونه Aeromona متعلق به رده های مختلفی هستند که جدا شدند.
دو محقق به نام های C.Grosser وV.Pesic در دو مرحله ، تحقیق درباره
پراکندگی انواع زالودر ایران را به انجام رساندند.اولین تحقیق شامل شهرهای
کرمان ، مازندران ،مرکزی ، اصفهان ، یزد ، همدان ، چهارمهال وبختیاری ،
در حالیکه دومین سفر استانی شامل خراسان ، لرستان و کرمانشاه بود .شناخت
اقلیم زالو متاسفانه در ایران ضعیف می باشد وکلید شناخت در این نواحی کم است
اما در یک بازنگری موقعیت جغرافیایی ایران ، تنوع وفراوانی غنی از گونه
های زالومورد
انتظار بود.
زالوها توسط دست ویا گاز انبر از زیرزمین ویا لابلای سنگ ها در رودخانه
جمع آوری شدند. زالوها جهت شستشوابتدا در اتانل 10 درصد وسپس جهت
برداشتن موکوس سطحی در اتانل 70 درصد قرار داده شد. نتایج حاصل شده
از تعداد و فراوانی پراکندگی زالوها در جدول ذیل خلاصه شده است.
فراوانیتعدادرده
25.5%13Glossiphoniidae17.6%9Helobdella stagnalis5.9%3Hemiclepsis marginata2.0%1Placobdella cotata2.0%1Haemopidae2.0%1Haemopis sanguisuga9.8%5Hirudinidae7.8%4Hirudo sp2.0%1Limnatis nilotica62.7%32Erpobdellidae9.8%5Er pobdellidae spec33.3%17Dina blanchard2.0%1Dina sp



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه ارشد

پاسخ دهید